如何构建一个基因的过表达载体

如何构建一个基因的过表达载体

当拿到一个基因的DNA片段后，就需要把它导入一个载体，一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。

常用的载体有细菌质粒，噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。所谓载就是一个很长的环状DNA，携带一些基因，可以导入细菌中自我复制，也可以从细菌中提取出来改造。

现在我们就需要把SUN片段连到一个载体，用VectorNTI打开，研究一下用哪个酶处理，这个载体需要用Sma1这个酶切开，然后用SUN连上，替换切下来的ccdb，这里要用到两个酶，一个Sma1限制性内切酶切开，一个DNA连接酶把新片段连上，植物转基因载体和这些酶都是非常常用的试剂。

载体构建好之后需要把它们导入大肠杆菌中复制，这里就要用到大肠杆菌的感受态了，十把构建好的载体和感受态混合，然后放到42度热水处理个1分钟，再冰上放个3分钟。

这时需要一些培养细菌的培养基来培养菌们，大肠杆菌这种菌很好养活，唯一需要注意的是，灭菌过后的培养基要小心保存。把在冰上处理过的大肠杆菌放到培养基中培养一天，为了防止没有转入载体的菌也混进来，我们在载体上加入了一个抵抗抗生素的基因。

这样我们在培养基中加入这种抗生素，在里面就只有需要的大肠杆菌能生长了。最后得到了上亿个携带着含有我们的SUN基因的载体的大肠杆菌，这时就需要把质粒再提出来。

实验室里提质粒需要用专门的试剂盒，也可以简化一下，先把菌液离心让菌沉淀，然后再用水把菌打散，然后煮沸1分钟再离心，取上清，上清中加乙醇让DNA析出，再离心让DNA沉淀，最后用水把DNA溶解。这样提出来的DNA会有很多杂质以及细菌的基因组DNA。

扩展资料：

目的基因与运载体结合：

将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，

要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处。

首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来。

形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

参考资料来源：百度百科-基因表达载体