端粒与端粒酶是如何发现的？

端粒与端粒酶是如何发现的？

1．2端粒延长机制与端粒酶的发现在1984年报道酵母端粒序列的同一篇文章中．ElizabethH．Blackburn还发现，不论是四膜虫还是酵母自身的端粒序列都可以在酵母中被保护和延伸。而带着四膜虫端粒的DNA人T染色进入酵母后。其末端会被加上酵母的而非四膜虫的端粒重复序列【13I。此后，同源重组、转座元件、端粒回文或发卡结构等很多关于端粒复制分子机制的假说和模型相继被提出。由于端粒是由重复序列组成的．所以当时人们普遍倾向于同源重组机制的假说。但同源重组只能复制自身的序列，而对于四膜虫端粒被加上酵母端粒序列而不是四膜虫本身端粒序列的现象，同源重组假说根本无力解释。那么会不会是酵母中存在一种从未被发现的“酶”来复制端粒DNA呢?要证实这个假说，最有效的方法就是找到这个“酶”。1984年，Carol W．Greider作为博士研究生进入ElizabethH．Blackburn实验室．开始了端粒末端合成机制的研究工作。假设端粒是由某种酶合成，那么在细胞裂解液里应该有这种酶的存在．如果使用四膜虫细胞裂解液在体外能检测到端粒序列的复制和延伸．那无疑证实这种“酶”的存在并推翻同源重组的假说。Carol W．Greider和Elizabeth H．Blackburn沿着这种思路。并根据四膜虫rDNA端粒重复序列，人工合成了其互补重复序歹d[TFGGGG],寡聚核苷酸，将其作为端粒合成起始的引物与高浓度的四膜虫细胞裂解液一起孵育，通过放射性标记的核苷酸来检测体外端掌6=序列的合成。结果显示，当四膜虫细胞裂解液加A．[1TGGGG]4或酵母端粒序列DNA时，其明显被重新加上了DNA碱基．而且以6个碱基递增的方式延长，与四膜虫端粒重复基本单位为6个碱基正好吻合，而对于随机序列的DNA引物则并不发生延伸1141。实验结果证明，端粒DNA的延伸是通过“酶”来完成的，否定了同源重组的假说。这种酶后来被命名为“端粒酶”(telomerase)。随后．Carol W．Greider和Elizabeth H．Blackburn继续研究端粒酶的特性。她们通过RNA酶降解四膜虫裂解液样品中的RNA．结果发现端粒酶活性竟然消失了，这证明端粒酶活性依赖于RNA[蜘峒。当时知道端粒酶依赖于蛋白，因为蛋白酶消化后的样品也不具备端粒酶活性fi4j。端粒酶活性同时依赖其RNA和蛋白成分，这种特性与核糖核蛋白复合体非常相似。Carol W．Greider和Elizabeth H．Blackbum据此推测其中RNA很可能决定了端粒重复片段的序列。1989年，CamlW．Greider通过跟踪端粒酶活性．用柱子纯化并成功克隆了四膜虫端粒酶RNA．发现其中一段RNA序列为C从CCC．CAA．正好与四膜虫的端粒DNA序列互补，端粒酶可能是利用这段序列作为模板复制端粒DNN切。之后，Elizabeth H．Blackburn研究小组发现，将这一RNA序列进行突变后会直接导致端粒序列的相应改变118I。这证明端粒酶RNA组分作为模板存在于端粒酶复合体中。端粒酶RNA功能被确定后，其蛋白亚基的鉴定成为下一个研究目标。既然端粒酶能够利用RNA模板亚基来复制DNA．那么很容易推测这个蛋白亚摹可能具有逆转录酶的活性，其中应该包括逆转录酶特有的结构域。1989年，Jack W．Szostak实验室利用一系歹『J遗传学筛选方法，在酵母中找到了邱r 1基因。这个基因突变会导致细胞分裂过程中端粒序列不断缩短。染色体缺失频率增加，最终出现细胞衰老和死亡的表型四。同时．Elizabeth H．Blackburn实验室在四膜虫上发现一个突变会引起相似的表型，这说明端粒可能在维持基因组稳定性和细胞增殖方面发挥着重要作用旧。此后，多个实验室参与到端粒酶蛋白亚基的寻找丁作中。1996年，Ceeh实验室用生化手段纯化了四膜虫端粒酶复合体，其中有一个蛋A根据分子量命名为p123m。同一时期，在酵母中几个与端粒复制密切相关的基因脚r 2，嬲丁3和耶T4相继被发现12“。四膜虫蛋白p123及酵母Est 2蛋白后来被证明是端粒酶的催化亚基：它们含有逆转录酶的结构域．如果对该结构域的关键氨基酸进行突变，则端粒酶活性消失五。此后，人们用体外转录和翻译系统共表达了端粒酶的催化亚基和RNA亚基，在体外重建了端粒酶活性，证明这两个核心亚基是端粒酶活性所必须的条件嘲。端粒与端粒酶的一系列发现完美地解释了两个问题：染色体末端由简单重复的端粒序列构成，端粒保护着染色体末端使之区别于一般的断裂染色体末端，从而不被各种酶降解，相互之间也不发生融合：端粒酶负责端粒的复制，端粒酶的催化亚基利用端粒酶自身的RNA亚基为模板不断复制出端粒DNA，从而弥补在染色体复制过程中的末端缺失．保证染色体的完全复制。